A esterilização real em tanque (esterilização real) é um processo de esterilização em que todo o meio de cultura preparado é inserido num biorreator-fermentador ou outro dispositivo, é introduzido vapor para aquecer o meio de cultura e o equipamento utilizado até à temperatura de esterilização, mantido durante um determinado período de tempo e depois arrefecido até à temperatura de inoculação, como se pode observar na Figura 1.
Figura 1 Diagrama esquemático da eliminação real
Este processo é também designado por esterilização intermitente ou esterilização em lote (em relação à esterilização contínua).
A operação de esterilização em tanque completo inclui, na realidade, três processos: aquecimento, conservação de calor e arrefecimento. A Figura 2 mostra as alterações de temperatura durante a esterilização do meio de cultura em tanque cheio.
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Figura 2 Variações de temperatura durante a esterilização das latas
Passos específicos para esterilização de latas:
1. Inspeção de limpeza do tanque
Antes de limpar, verifique se o estado da válvula está correto. Ao limpar, tenha atenção para verificar se existem fugas nos equipamentos e tubagens, principalmente nas tubagens de refrigeração.
Verifique se a água condensada na camisa do fermentador foi drenada para garantir que não há água de refrigeração na camisa.
Após a limpeza, verifique o interior do depósito para ver a cor original sem sujidade evidente.
2. Preparação antes da esterilização
Esterilize o filtro de ar do fermentador e seque-o com ar estéril.
Verifique se o depósito está despressurizado. Insira o elétrodo limpo e calibrado no depósito e ligue o fio do elétrodo. Verifique se a válvula do fundo do depósito está fechada.
De seguida, adicione os materiais preparados no tanque, adicione a água necessária para completar o volume de acordo com as exigências do processo, adicione o antiespumante e verifique se falta algum material. Após a conclusão, mexa para evitar que o líquido assente.
3. Aquecimento
(1) Aquecimento indireto
Abra as válvulas de escape do corpo do tanque, ao mesmo tempo, desligue a água de refrigeração da camisa, abra a válvula de vapor da camisa ou da serpentina, introduza vapor na camisa ou serpentina para aquecer indiretamente o líquido, abra ligeiramente o dreno do tubo de entrada de água da camisa válvula e descarregar a água condensada no corpo do tanque e na camisa.
Quando a temperatura do depósito subir para 80-90°C, feche gradualmente a válvula de escape.
O papel do pré-aquecimento do vapor da camisa:
①Reduza a geração de água condensada e garanta a precisão do volume do meio de cultura após a desinfeção.
No início, o vapor é introduzido diretamente no tanque, e o material frio no tanque é lançado diretamente no vapor, o que provavelmente produzirá uma grande quantidade de água condensada e tornará o volume do meio de cultura muito grande após o consumo. Algumas fábricas omitem esta etapa e necessitam de controlar a quantidade de água condensada gerada através de experiências para garantir a concentração do meio de cultura.
②Reduza o ruído.
A diferença de temperatura entre o material e o vapor é muito grande e a introdução direta de vapor vai provocar vibração no equipamento.
③ É propício à gelatinização e liquefação de matérias-primas ricas em amido. (Isto não se aplica às matérias-primas sem amido)
A temperatura da camisa aumenta relativamente lentamente, o que é benéfico para a dissolução completa dos materiais que podem não ser completamente dissolvidos no meio de cultura para materiais amiláceos, e evita a gelatinização e aglomeração da superfície do material causada pelo aumento muito rápido da temperatura, que afeta o efeito de esterilização.
(2) Aquecimento direto
Depois de pré-aquecer a camisa a 80-90°C, feche a válvula de entrada de vapor da camisa (também pode ser fechada), abra a válvula de entrada de vapor do tanque e permita que o vapor flua diretamente para o tanque para aumentar a temperatura do tanque para 118-121°C . Abra várias válvulas de escape e pare de mexer.
4. Isolamento térmico e de pressão
Quando a temperatura do material estiver próxima da temperatura especificada pelo processo, reduza gradualmente a válvula de vapor e ajuste o equilíbrio de cada válvula de modo a fazer com que a pressão e a temperatura atinjam continuamente a pressão e a temperatura exigidas pelo processo (geralmente ligeiramente superior à temperatura da cultura em 0,5-2 ℃, caso contrário, descerá muito).
Neste momento, todas as tubagens ligadas ao reactor devem estar em dois estados: entrada de vapor ou saída de vapor, para esterilizar as tubagens.
Durante a etapa de isolamento, o vapor deve ser introduzido em todas as tubagens abaixo do nível do líquido do meio de cultura; o vapor deve ser descarregado de outros tubos acima do nível do líquido, de modo a garantir uma esterilização completa sem cantos mortos. O isolamento é geralmente de 121°C durante 25-30min.
Os tanques de fermentação gerais possuem geralmente três aberturas (tubo de entrada de ar, tubo de descarga e tubo de amostragem) para a entrada de vapor, que é a chamada "entrada de vapor de três vias".
"Saída de vapor de quatro vias" significa que o vapor é descarregado diretamente dos tubos de exaustão, inoculação, alimentação e antiespumante. Principalmente nestas quatro vias, as válvulas de entrada e saída de vapor também têm de ser abertas.
5. Colagem
Após a esterilização, feche primeiro todas as válvulas de entrada de vapor e reduza ligeiramente a válvula de escape. De seguida, abra a válvula de entrada de ar para deixar entrar ar estéril e manter a pressão do tanque. De notar que a pressão no tanque deve ser inferior à pressão do filtro de ar para evitar o retorno do meio de cultura.
Por fim, abra a válvula de água de refrigeração e passe água fria pela camisa ou bobina para um arrefecimento rápido, comece a mexer e arrefeça o meio de cultura até à temperatura exigida pelo processo de fermentação.
Após a esterilização, o ar estéril precisa de ser introduzido a tempo de garantir a pressão dentro do tanque (geralmente a pressão do tanque é ajustada para 0,1 MPa) antes de ser adicionada água de arrefecimento para arrefecimento.
A função da introdução de ar estéril é acelerar o arrefecimento e manter a pressão positiva no tanque, para evitar que o arrefecimento do meio de cultura forme uma pressão negativa no tanque, que é fácil de ser infectada por bactérias ou fazer com que o biorreator- fermentador possa ser danificado (a pressão do tanque do biorreator-fermentador cai para zero e o corpo do tanque é sugado). Trata-se de um acidente que ocorre frequentemente na operação de esterilização de tanques de fermentação encamisados em aço inoxidável. Trata-se de um grave acidente de produção.
Os quatro critérios seguintes são utilizados para julgar a qualidade da esterilização dos tanques de meio de cultura:
① Cumprir os requisitos de esterilidade após a esterilização;
②Menos destruição de nutrientes;
③ O volume do meio de cultura após a esterilização é consistente com o volume da ração;
④Menos espuma.
Várias questões devem ser atentas durante o processo de esterilização:
(1) O papel da agitação de esterilização
Na esterilização completa da lata, a agitação desempenha um papel muito importante.
O objetivo de ligar a agitação:
① Fazer com que os materiais esterilizados sejam aquecidos e transferidos uniformemente para evitar a formação de falsas pressões durante o processo de esterilização da lata;
② Evite a sedimentação do material. Uma vez que ocorra sedimentação e estratificação, isto causará uma temperatura de aquecimento inconsistente e gerará facilmente uma pressão falsa.
(2) Alterações no volume do líquido após a esterilização
Na preparação do meio de cultura, deve ter-se em conta o aumento do volume do meio de cultura após a esterilização.
Quanto maior for o tempo de esterilização, mais aumenta o volume. Quanto mais baixa for a temperatura, maior será o volume de vapor que entra, aumentando geralmente cerca de 10%, o que está relacionado com a qualidade do vapor.
A camisa não está pré-aquecida ou pré-aquecida insuficientemente, a água condensada na tubagem de vapor não é completamente drenada, o vapor enviado da sala da caldeira contém muita água, etc., o que formará muita água condensada e aumentará o volume.
(3) Consideração do tempo de esterilização das latas
Na produção de fermentação industrial, o estágio de conservação do calor é geralmente considerado o tempo de esterilização. Agora são geralmente utilizados 121°C e 30min.
Contudo, o tempo de manutenção da esterilização necessário para alcançar o mesmo efeito de esterilização em fermentadores de tamanhos diferentes é teoricamente diferente.
O biorreator-fermentador de 40m3 é esterilizado e o tempo teórico de esterilização é calculado por a fórmula
Figura 4 Calcule o tempo teórico de esterilização.
t —— indica o tempo teórico de esterilização, s;
N0 —— o número original de bactérias viáveis no início da esterilização (t=0), células/mL;
Nt —— Número de bactérias vivas remanescentes após o tempo t, células/mL;
k——constante de taxa de mortalidade bacteriana, s-1, que está relacionada com o tipo de microrganismo e com a temperatura.
Admita que o meio de cultura contém 2 × 107 esporos de bactérias resistentes ao calor/mL e que a taxa de esterilização constante a 121 ℃ é de 0,0287s-1.
O tempo necessário para obter a probabilidade de falha da esterilização de 0,001 é de 23,9 minutos. O efeito de esterilização dos dois estados do meio de cultura aumentando da temperatura ambiente para 121°C e descendo de 121°C para a temperatura da cultura de fermentação não é aqui tido em conta.
De facto, o aquecimento e o aumento da temperatura contribuem para a esterilização do meio de cultura, especialmente quando o meio de cultura é aquecido acima dos 100°C, este efeito é mais evidente.
Se o efeito de esterilização do meio de cultura durante a fase de aquecimento for tido em conta, e se forem necessários 15 minutos para aumentar a temperatura do meio de cultura de 100°C para 121°C, o tempo de esterilização durante a fase de isolamento é calculado em 21,1 minutos, e o tempo de isolamento é reduzido em 12%.
Quanto maior for o volume do tanque de fermentação, maior será o tempo de aquecimento para a esterilização do tanque, maior será o impacto da fase de aquecimento na esterilização e menor será o tempo de isolamento correspondente.
Os tanques pequenos aquecem rapidamente e o tempo de aquecimento pode ser ignorado. Os tanques de fermentação actualmente utilizados na indústria de fermentação são relativamente grandes (60-100m3), e o efeito de esterilização durante a fase de aquecimento deve ser considerado para minimizar a destruição de nutrientes.
Para tanques de fermentação com um volume inferior a 40m3, este efeito pode ser ignorado.
Além disso, a etapa de arrefecimento também contribui até certo ponto para a esterilização, mas hoje em dia são comummente utilizadas medidas de arrefecimento rápido, que são de curta duração e geralmente não são tidas em conta nos cálculos.